Helicobacter pylori является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Это значительная причина заболеваемости и смертности из-за язвенной болезни и рака желудка. Уровень инфицирования в мире составляет около 50 %, причем в развивающихся странах этот показатель выше, чем в развитых. Так в Китае инфицировано около 84,62 %.
Helicobacter pylori — грамотрицательная бактерия спиралевидной формы, приводящая к развитию гастрита, язвы желудочно-кишечного тракта, лимфопролиферативной лимфомы желудка и даже рака желудка. H. pylori заражает людей фекально-оральным или орально-оральным путем, после чего остается в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки [1]. В основном вызывает бессимптомный хронический гастрит, однако у 15-20 % инфицированных людей развиваются заболевания, связанные с хроническим воспалением, такие как пептическая язва, а у 1-3 % инфицированных развивается рак желудка или лимфома, связанная со слизистой оболочкой.
Комбинации антибиотиков могут вылечить инфекцию H. pylori, но часто случается рецидив, и развивается лекарственная устойчивость. В настоящее время существует четыре основных режима лечения H. pylori первой линии: тройная терапия, содержащая кларитромицин; последовательная терапия; сопутствующая терапия и четырехкратная терапия висмутом. Последняя является рекомендуемым методом лечения первой линии. Для пациентов, ранее не применявших макролиды, а также для пациентов, проживающих в районах с низкой частотой резистентности к кларитромицину, рекомендуется 14-дневная тройная терапия, содержащая этот антибиотик [2]. Хотя тройная терапия, содержащая кларитромицин, изначально обеспечивает частоту радикального излечения > 90 % [3], из-за увеличения лекарственной устойчивости к макролидам, в основном к кларитромицину, эффективность этих методов лечения снизилась до 80 % в большинстве частей мира. Противовоспалительные и антиоксидантные механизмы пробиотиков могут улучшить микроэкологию кишечника и общее состояние здоровья, но не могут увеличить скорость ликвидации H. pylori инфекции [4]. При этом пробиотическая терапия может использоваться только в качестве дополнительной терапии для уменьшения побочных эффектов, связанных с приемом антибиотиков [5]. На эффективность лечения заболеваний, вызванных H. pylori , могут влиять различные факторы: кислотность желудка, курение, употребление алкоголя, прием пациентом определенных лекарств, метаболизм лекарств, общее физическое состояние, генотип бактерий, бактериальный статус и устойчивость к противомикробным препаратам — все это может влиять на терапевтический результат.
Одной из перспективных стратегий профилактики и терапии инфекции H. pylori является создание вакцины. Вакцинация эффективна в профилактике и терапии инфекционных заболеваний и была подтверждена сотнями лет практики применения. Понимание иммунных реакций против H. pylori имеет решающее значение для разработки эффективных и безопасных вакцин.
Антигены Helicobacter pylori
H. pylori способны выживать в чрезвычайно кислой среде, что тесно связано со жгутиком, который необходим для передвижения бактерий. Таким образом они достигают защитного слоя слизи на поверхности слизистой оболочки желудка. Н. pylori имеет несколько хеморецепторов, таких как TlpA, B, C и D, которые необходимы для хемотаксиса. Никель участвует в формировании уреазы и гидрогеназы, которые необходимы для выживания Н. pylori в кислой среде [6].
Уреаза H. pylori — это полифермент, состоящий из 12 гетеродимеров UreA и UreB, на долю которых приходится 10–15 % от общего содержания белка в бактериях [7]. Уреаза может катализировать гидролиз мочевины до CO2 и NH3. Аммиак может нейтрализовать избыток желудочной кислоты, подавлять функцию нейтрофилов [8], способствовать образованию цитотоксичных соединений, полученных из NH3 [9] и разрушать целостность соединений эпителиальных клеток желудка [10–11], обеспечивая условия для колонизации патогенов в нем. CO2 может защитить бактерии от цитотоксичности ONOO–, способствуя распространению патогенов [12]. Дискретная поверхность уреазного комплекса может напрямую взаимодействовать с компонентами хозяина, участвующими в иммуномодулирующей активности, обеспечивая тем самым непрерывную колонизацию H. pylori [13]. Ингибирование активности уреазы ухудшает способность H. pylori колонизировать желудок и играет роль в профилактике и лечении H. pylori [14]. В большинстве исследований использовалась уреаза в качестве антигена-кандидата, и было показано, что инъекция рекомбинантной плазмиды pcDNA3.1(+)-ureA при введении мышам может стимулировать иммунный ответ у животных, инфицированных H. pylori [15]. Интраназальная иммунизация рекомбинантной вакциной UreB с растительными полисахаридами в качестве адъювантов защищала мышей от инфекции H. pylori, что может быть связано с повышением специфичности sIgA для желудочно-кишечного тракта и Т-клеточного ответа Th1/ Th17 CD4+ [16].
Цитотоксин-ассоциированный ген A (CagA) является основным вирулентным фактором H. pylori, который связан с канцерогенезом. После транслокации в клетки-мишени CagA активирует различные внутриклеточные сигнальные пути, такие как NF-κB и EGFR-MAPK, что в конечном итоге приводит к повреждению ДНК в эпителиальных клетках желудка [17], что является основным механизмом возникновения рака желудка, вызванным Н. pylori. Длина теломер при раке желудка, вызванном Н. pylori, и прилегающих тканей короче, чем в тканях желудка без Н. pylori. Укороченная теломера была связана с повышенной экспрессией IL-1B и NF-κB [18].
Антиген вакуолизирующего цитотоксина (VacA) является еще одним важным вирулентным фактором H. pylori, и почти все штаммы H. pylori несут в себе vacA ген, но только 50–60 % штаммов экспрессируют его, и разные vacA генотипы обладают разной вирулентностью. В кислой среде VacA может воздействовать на Na+-K+ АТФазу клетки-мишени и нарушает ионно-белковую функцию, повреждает лизосомы и эндоплазматический ретикулум, что в конечном итоге приводит к клеточной вакуольной дегенерации [19]. Инфицирование H. pylori приводит к привлечению в желудок множества воспалительных клеток, включая дендритные клетки, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, Т-клетки и В-клетки. Привлеченные иммунные клетки секретируют ряд провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1, фактор некроза опухоли (TNF), гамма-интерферон (IFN-γ) и IL-2, что приводит к хроническому активному воспалению [20]. H. pylori имеет ряд стратегий для борьбы с неблагоприятными условиями в желудке человека, а также успешные механизмы для уклонения от сильных врожденных и адаптивных иммунных реакций, вызываемых инфекцией. H. pylori обходит врожденную иммунную систему, избегая обнаружения рецепторами опознавания паттерна (PRR), ингибируя фагоцитоз, активные формы кислорода и уничтожение оксида азота [21]. Более того, H. pylori разработали множество механизмов, позволяющих активно уклоняться от адаптивного иммунитета, вмешиваясь в модуляцию ответов Т-клеток.
Какие разрабатываются вакцины от Helicobacter pylori ?
Инактивированная цельноклеточная вакцина
Инактивированная цельноклеточная вакцина (WCV) — это традиционная вакцина, которая содержит все антигены определенного патогена, поэтому она имеет сложные антигенные компоненты и может индуцировать эффективный иммунный ответ. Первое испытание инактивированной цельноклеточной вакцины на людях была опубликована в 2001 году [22]. Применению WCV у людей долгое время препятствовал тот факт, что она оказывает иммунопротекторное действие только в сочетании с сильными адъювантами для слизистой оболочки, такими как CT или LT, которые обладают значительной энтеротоксичностью. WCV содержат много неизвестных компонентов и имеют недостатки, такие как высокие побочные эффекты, низкая специфичность и склонность вызывать перекрестные иммунные реакции. С разработкой более безопасных вакцин, таких как субъединичные вакцины и вакцины с нуклеиновыми кислотами, исследования по цельноклеточным вакцинам постепенно сократились.
Векторная вакцина
Векторная вакцина — это вакцина нового типа, где в качестве переносчика используются ослабленные или нетоксичные бактерии или вирусы с сохранной способностью к инвазии в слизистые оболочки, а последовательность, кодирующая иммуногенные белки конкретного патогена, может встраиваться в геном переносчика, поэтому при попадании в организм человека этот рекомбинантный вектор может экспрессировать специфический антиген и стимулировать иммунный ответ организма, предотвращая заражение соответствующим патогеном.
Аттенуированные вакцинные штаммы сальмонеллы могут экспрессировать большое количество чужеродных антигенов и широко используются при создании векторных вакцин. Субъединицы уреазы А и В H. pylori были клонированы и экспрессировались в аттенуированном виде Salmonella typhimurium. Мышам вводили мутантный штамм SL3261 aroA и однократную пероральную дозу этой рекомбинантной бактерии, затем мышам делали пероральную атаку диким типом H. pylori. Результаты показали, что рекомбинантная вакцина обладает 100% защитой от инфекции H. pylori [23]. Однако пероральное введение рекомбинантных вакцин не дало удовлетворительных результатов у людей [24].
Субъединичная вакцина
Субъединичные вакцины являются горячей точкой в исследовании вакцин. В качестве потенциальной вакцины они содержат только специфические антигенные компоненты, поэтому ингредиенты просты и понятны, обладают большей безопасностью и относительно меньшей вероятностью вызвать перекрестные иммунные реакции. Благодаря развитию генной инженерии антигенные белки стало проще получать, и их можно приобретать в больших количествах промышленным путем.
В 1990 году Паллен и соавторы сочли многообещающей антиуреазную вакцину [25]. Большинство вакцин, которые вступили в стадию клинических исследований, содержат уреазный антиген [26–38]. Цинн и соавторы в 1991 году предположили, что пероральный антиген H. pylori с холерным токсином могут повышать уровень антител в сыворотке крови и кишечном тракте [39]. Затем в 1993 году Цинн и др. доказали, что устойчивость к H. pylori обусловлена IgG и IgA, вырабатываемыми при пероральной иммунизации. Активная пероральная или пассивная иммунизация IgA может обеспечить устойчивость к H. pylori у мышей [40]. С тех пор поиск вакцины против H. pylori вступил в период быстрого развития. В процессе было идентифицировано более 10 видов антигенов-кандидатов для использования отдельно или в комбинации, почти 10 видов адъювантов, которые были протестированы для усиления иммунного ответа, и были внедрены различные системы доставки, облегчающие презентацию антигена.
В настоящее время антигены-кандидаты для субъединичной вакцины против H. pylori включают UreB (B субъединица уреазы H.pylori), адгезин А (HpaA), CagA, VacA, Hsp и LPS [41]. В исследованиях иммуногенности этих антигенов-кандидатов было продемонстрировано, что антитела против субъединицы уреазы В можно контролировать у всех инфицированных пациентов, в то время как антитела против VacA могут быть обнаружены менее чем у половины из них [42]. H. pylori субъединичные вакцины являются одними из наиболее успешных видов вакцин, и некоторые из них были включены в фазу I, фазу II и даже фазу III клинических испытаний и получили удовлетворительные результаты.
Вакцина против нуклеиновых кислот
Вакцина против нуклеиновых кислот представляет собой вакцину третьего поколения, в случае которой пациентувводят рекомбинантную эукариотическую экспрессирующую плазмиду, содержащую кодирующую последовательность целевого белка, затем клетки хозяина экспрессируют антигенный белок и индуцируют специфический иммунный ответ. По сравнению с вакцинами первого и второго поколения, вакцины на основе нуклеиновых кислот обладают следующими преимуществами: сильный иммунитет, простота приготовления, безопасное применение, длительный иммунитет и способность вызывать как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции.
Ansari H амплифицировала кодирующую последовательность флагеллина A (FlaA) методом ПЦР, клонировала продукты ПЦР в вектор pBudCE4.1 и сконструировала вакцину на основе нуклеиновых кислот FlaA. Они ввели рекомбинантный вектор в фибробласты кожи человека и обнаружили, что белок FlaA может успешно экспрессироваться, а внутримышечная инъекция мышам этой рекомбинантной плазмиды может повышать уровни цитокинов и иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей. Эти результаты показали, что вакцина против нуклеиновых кислот FlaA обладает способностью вызывать эффективный иммунный ответ у мышей.
Также была разработана вакцина против нуклеиновых кислот (pcDNA3.1 (+)-cagW-CS-NPs) путем инкапсуляции вакцины против нуклеиновых кислот гена CagW в наночастицы хитозана (CNP), что вызвало сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ и защиту от H. pylori. Было показано, что CNP, вероятно, усиливают клеточный и гуморальный иммунитет и предотвращают расщепление ДНК ДНКазой I, что делает их очень эффективными средствами доставки такой вакцины [43].
Эпитопная вакцина
Эпитопная вакцина — это разновидность вакцины, приготовленная с использованием антигенного эпитопа, который является ключевой частью, активирующей иммунный ответ в молекуле антигена. В зависимости от типа иммунных клеток, которые распознают антигенные эпитопы, последние могут быть классифицированы как Т-клеточные антигенные эпитопы, В-клеточные антигенные эпитопы и многоклеточные антигенные эпитопы, которые содержат оба типа клеток. Соответственно, эпитопные вакцины также могут быть классифицированы как Т-эпитопные вакцины, В-эпитопные вакцины и многоклеточные эпитопные вакцины. Их легче производить, чем ослабленные вакцины, и они не содержат токсичных компонентов патогена, поэтому теоретически они не представляют потенциальной угрозы для здоровья. Вакцины с В-клеточным эпитопом и вакцины с Т-клеточным эпитопом могут индуцировать гуморальные и клеточные иммунные реакции соответственно, что приводит к профилактическому и терапевтическому эффектам. Эпитопная вакцина считается одной из наиболее перспективных вакцин будущего.
Были идентифицированы три линейных В-клеточных эпитопа, которые расположены на 158–172, 181–195 и 349–363 аминокислотных последовательностях в 19 фрагментах гена UreB, охватывающих 15 аминокислотных остатков. Мышей вакцинировали гибридным пептидом, который содержит эти три эпитопа и глутатион-S-трансферазу (GST), и обнаружили, что специфическое антитело, индуцируемое этой вакциной, обладает способностью ингибировать уреазу [44].
В 2020 году Чжан Джей подал заявку на патент на изобретение вакцины с В-клеточным эпитопом против H. pylori HpaA, активным ингредиентом которого является пептид-эпитоп В-клеток с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 1 и / или SEQ ID No: 2.
В 2021 году Ru Z выделил восемь линейных эпитопов В-клеток, четыре HTL-эпитопа и три CTL-эпитопа белков FlaA и UreB из штамма H. pylori , последовательно связавшие доминантные эпитопы с соответствующими линкерами, связал внеклеточный домен CTLA-4 с N-концом последовательности эпитопов. Иммунобиоинформационный анализ показал, что многоэпитопная вакцина обладает сильным взаимодействием с B7 и toll-подобными рецепторами, и эффективность вакцины была подтверждена с помощью клонирования in silico. Эти анализы подразумевают высокую эффективность разработанных эпитопных вакцин против Н. pylori [45].
