В первые месяцы пандемии COVID-19 медицинские работники, интерпретирующие результаты тестов, заметили странную особенность: пациенты, уже переболевшие COVID-19, необъяснимым образом получали положительный результат ПЦР-теста спустя несколько недель или даже месяцев после болезни.
Несмотря на возможность повторного заражения COVID-19, случаи данных пациентов не относились к этой категории — из их образцов биоматериала живой вирус не был выделен. Согласно некоторым исследованиям, такие ложноположительные результаты наблюдались даже во время пребывания их участников в карантине. Помимо того, у РНК, как правило, короткое время существования в макроорганизме — буквально несколько минут. Поэтому маловероятно, что положительные результаты тестов стали результатом сохранения остаточных молекул РНК.
Новое исследование Рудольфа Джениша, профессора биологии Массачусетского технологического института и сотрудника лаборатории института Уайтхеда, может объяснить, почему у некоторых пациентов сохраняются положительные результаты ПЦР-тестов на COVID-19 после выздоровления. В статье, опубликованной 6 мая в журнале «Proceedings of the National Academy of Sciences», Джениш с соавт. показывают, что участки генетической последовательности из РНК-вируса SARS-CoV-2 могут интегрироваться в геном клетки-хозяина посредством обратной транскрипции. Затем эти участки генома могут быть «считаны» обратно в РНК, что может быть обнаружено с помощью ПЦР-теста.
SARS-CoV-2 — не единственный вирус, способный интегрироваться в геном человека. Около 8 % нашей ДНК состоит из остатков древних вирусов. Некоторым вирусам, как, например, ретровирусам, для саморепликации жизненно необходимо встроиться в ДНК человека. Лигуо Чжан, первый автор статьи, специалист из института Уайтхеда, отмечает, что SARS-CoV-2 не является ретровирусом, а следовательно, ему не нужен процесс обратной транскрипции для саморепликации. Тем не менее, последовательности не ретровирусной РНК были обнаружены в геноме многих видов позвоночных, включая человека.
Чжан и Джениш, учитывая эти факты, начали планировать эксперименты, чтобы проверить, может ли такая вирусная интеграция происходить в случае с вирусом SARS-CoV-2. Объединив усилия с Алексией Ричардс, специалистом из лаборатории Джениша, исследователи заражали человеческие клетки коронавирусом в условиях лаборатории, а затем, через два дня, секвенировали ДНК инфицированных клеток и искали в ней генетический материал вируса.
Чтобы убедиться, что результаты работы могут быть воспроизведены с помощью другой методики, ученые использовали три различных способа секвенирования ДНК. Во всех образцах они обнаружили фрагменты вирусного генетического материала (хотя исследователи подчеркивают, что ни одного из встроенных фрагментов генетического материала не хватило бы для репликации и сборки полноценного живого вируса).
Для того, чтобы разгадать, посредством какого механизма эти небольшие вирусные последовательности попали в человеческий геном, Чжан и Джениш с соавт. исследовали фланкирующие фрагменты ДНК, т. е. расположенные по обе стороны от участков вирусных последовательностей. В этих фрагментах ДНК ученые обнаружили отличительный генетический элемент — ретротранспозон.
Транспозоны, иногда называемые «прыгающими генами», представляют собой участки ДНК, которые могут перемещаться из одной области генома в другую. Они подвергаются активации и «прыгают» в условиях сильного стресса, в случае развития злокачественных опухолей, или же старения, и являются значимыми маркерами генетических изменений.
Один из распространенных транспозонов в геноме человека — ретротранспозон LINE1, который состоит из комбинации молекулярного комплекса, участвующего в разрезании ДНК, и обратной транскриптазы (фермент, который создает молекулы ДНК на матрице РНК; например, на матрице РНК SARS-CoV-2).
По словам Джениша, интеграция LINE1 очень хорошо заметна: на стыке
вирусной последовательности и ДНК клетки человека происходит дупликация
из 20 пар оснований.
Помимо дупликации, еще одним элементом,
свидетельствующим об интеграции с помощью LINE1, является
последовательность распознающей эндонуклеазы LINE1. Исследователи
обнаружили этот фрагмент почти в 70 % ДНК, содержащих вирусные
последовательности. Однако с учетом того, что не в 100 %
последовательностей ДНК были обнаружены следы транспозонов,
предполагается, что вирусная РНК может интегрироваться в клеточную ДНК
несколькими разными способами.
Микрофотография клеток рака легкого, инфицированных вирусом SARS-CoV-2 Синим цветом окрашена ДНК, зеленым — белок нуклеокапсида SARS-CoV-2, а красным — двухцепочечная РНК, возникающая в ходе репликации вирусного генома. Согласно данным нового исследования, проведенного в лаборатории Джениша, предполагается, что определенное количество вирусной РНК может быть подвергнуто обратной транскрипции и интегрировано в геном человека. Это может объяснить, почему некоторые пациенты получают положительный результат ПЦР-тестов на COVID-19 даже после выздоровления.
Для оценки вирусной интеграции исследователи проанализировали опубликованные сведения о РНК-транскриптах из разных типов образцов, включая образцы биоматериала от пациентов с COVID-19. С помощью этих данных Чжан и Джениш смогли вычислить долю транскрибированных генов в клетках этих пациентов, содержащих вирусные последовательности, которые могли быть получены из вирусных копий, уже встроенных в геном. Процент варьировал от образца к образцу, но в некоторых из них значительная часть вирусных транскриптов была транскрибирована именно из вирусного генетического материала, интегрированного в геном.
Предыдущая версия данной статьи с таким выводом была опубликована в
Интернете на сервере препринтов bioRxiv. Однако недавнее исследование
свидетельствует о том, что, во всяком случае, некоторые из
клеточно-вирусных последовательностей могут быть артефактами
секвенирования РНК, что может вводить в заблуждение. В текущей редакции
статьи исследователи устранили влияние этих артефактов, искажающих
интерпретацию результатов.
Вместо обычного подсчета транскриптов, содержащих вирусный материал, исследователи изучали направление считывания транскриптов. Если обнаружение вирусной последовательности — результат существования живого вируса или пребывания, по крайней мере, вирусных РНК в клетке, то большинство вирусных транскриптов были бы считаны в правильном направлении для рассматриваемых последовательностей; в культуре инфицированных клеток более 99 % вирусных транскриптов правильно ориентированы. Однако если бы транскрипты были продуктом случайной интеграции вируса в геном, то произошло бы разделение примерно 50 на 50 — половина транскриптов была бы прочитана по направлению вперед, а другая половина — назад относительно генов хозяина. Чжан отмечает, что это явление ученые наблюдали в образцах некоторых пациентов. Это значит, что большая часть вирусной РНК в некоторых образцах может быть транскрибирована из интегрированных последовательностей.
Поскольку данные, которые использовались учеными, были довольно ограниченными, Джениш подчеркивает, что необходимо больше информации, чтобы понять, насколько распространено это явление и что оно может означать для здоровья человека.
Возможно, что вирусная интеграция наблюдается лишь в немногих клетках человека. В случае иных РНК-вирусов, которые интегрируются в геном клетки-хозяина, только небольшая доля инфицированных клеток (от 0,1 % до 1 %) содержала интегрированную вирусную ДНК. Частота интеграции SARS-CoV-2 в клетки человека до сих пор неизвестна. По словам Джениша, доля таких клеток может быть очень незначительной. Ученый задается вопросом: «Даже если это и случается редко, факт остается фактом: 140 миллионов человек уже заражены коронавирусом, верно?».
В будущем Джениш и Чжан планируют исследовать, могут ли фрагменты генетического материала SARS-CoV-2 попадать в белки самой клетки при трансляции. Как заявляет Чжан, если такое будет наблюдаться, и вирусные белки будут способствовать формированию иммунного ответа, это может обеспечить постоянную защиту от вируса.
